热带作物学报

作者：洪克前, 谷会, 陈丽, 姚全胜

单位：中国热带农业科学院南亚热带作物研究所/海南省热带园艺产品采后生理与保鲜重点实验室,广东湛江 524091

关键词：菠萝,AcPLD2基因,原核表达,多克隆抗体,黑心病

基金：海南省自然科学基金项目(320MS087),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项——中国热带农业科学院院级创新团队项目(1630062017032),中央级公益性科研院所基本科研业务费专项——中国热带农业科学院院级创新团队项目(1630062017031)

菠萝是中国最具有特色和竞争优势的热带水果之一,但采后菠萝果实不耐贮藏,极易发生黑心病,严重影响果实品质和商品率,而且威胁菠萝产业的健康发展。因此减少采后菠萝损失直接关系到热区农民的经济收入。黑心病是采后菠萝果实一种常见的生理性病害,由于该病的生理机制尚不清楚,所以国内外尚未有完全控制黑心病发生的方法。目前关于菠萝黑心病的研究主要集中于黑心病生理过程描述和采后实用处理技术领域,而对其机理认识不足,严重制约了对黑心病问题的根本解决。前期的研究表明,菠萝果实AcPLD2基因可能参与了黑心病发生,但对其生理功能尚未解析。为了探究AcPLD2基因在采后菠萝果实黑心病中作用,制备了AcPLD2基因多克隆抗体。AcPLD2基因全长为2439个核苷酸,编码813个氨基酸,预测其分子量约为91 kDa,选取一个亲水性较高的片段即全长中N端第1~333个氨基酸序列,分子量大约57 kDa;将该序列片段插入到原核表达载体pET-30a(+)多克隆位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间,构建了原核表达载体pET-AcPLD2,并转化到大肠杆菌BL21（DE3）中诱导表达菌体蛋白。经SDS-PAGE电泳检测,结果表明重组蛋白成功获得了高效表达,分子量约为57 kDa。重组蛋白经纯化后免疫新西兰兔,获得了多克隆抗血清,采用Protein A/G纯化法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗血清通过间接酶联免疫分析,测定其效价比可达1∶1 600 000,表明所制备的抗体具有很好的灵敏性。进一步采用不同黑心病症状的菠萝果实组织总蛋白进行蛋白质印迹分析显示,在分子量91 kDa左右处出现特异的蛋白质条带,表明所制备的抗体可与菠萝AcPLD2蛋白特异性结合,且具有良好的特异性,暗示AcPLD2蛋白可能参与菠萝果实黑心病有一定的关系。该研究结果扩展了AcPLD2基因功能的认识,有利于进一步阐明采后菠萝果实黑心病的发生机制。

来源：2022年第2期

《热带作物学报》期刊编辑部

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