热带作物学报

作者：王艳玮, 曾凡云, 漆艳香, 丁兆建, 谢艺贤, 张欣, 彭军

单位：1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室,海南海口 571101,2.琼台师范学院生物科学系,海南海口 571127

关键词：香蕉枯萎菌4号生理小种（Foc4）,比卡菌素聚酮合酶基因Bik1,基因敲除,表型分析,CRISPR/Cas9基因编辑

基金：海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目(2019RC269),国家自然科学基金项目(31661143003),财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系专项(CARS-31-07)

香蕉枯萎病是由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）引起的香蕉毁灭性土传病害,其中4号生理小种（Foc4）能感染几乎所有的香蕉品系,危害最严重。本研究克隆鉴定Foc4比卡菌素聚酮合酶编码基因（bikaverin PKS-encoding gene, Bik1）Foc4Bik1,编码一个由2036个氨基酸组成的多功能酶,具有I型PKS聚酮合酶的保守结构域,包含酰基转移酶功能域[acyl-carrier protein (ACP) transacylase, SAT],β-酮脂酰合成酶功能域（β-ketoacyl synthase, KS）,丙二酰酰基转移酶功能域（acyltransferase, AT）,脱氢酶（dehydratase, DH）以及硫酯酶（thioesterase, TE）等多个保守蛋白结构域。采用Split-marker同源重组技术获得基因敲除突变体ΔFoc4Bik1,通过比较突变体和野生菌株生长速度、产孢量、致病力等差异,证明ΔFoc4Bik1突变体仅影响次生代谢产物比卡菌素的生物合成,不影响病原菌的其他生理表型及致病力;其次,ΔFoc4Bik1突变体摇培后菌液呈白色,与野生型Foc4的暗红色形成鲜明对比,说明Foc4Bik1基因符合作为内源报告基因的条件。本研究以Foc4Bik1为内源靶标基因,利用水稻恶苗病菌（F. fujikuroi）的基因编辑载体pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph,尝试以质粒体内表达Cas9和sgRNA的方式探索Foc4中CRISPR/Cas9编辑的可行性。gRNA序列由在线网站设计,构建的sgRNA162导入质粒构建靶向Foc4Bik1的pUC-fFuCas9-HTBNLS-hph-Foc4Bik1基因编辑载体,与供体质粒pUC19-Foc4Bik1-HDR一起导入原生质体通过同源重组修复（homology directed repair, HDR）的方式进行基因编辑。经过潮霉素抗性筛选获得的ΔFoc4Bik1（HDR）基因编辑后的敲除转化子进行PCR检测和摇培,白色菌液表型与PCR检测阳性的敲除转化子相互对应,证实了Foc4基因编辑的可行性。此外,Foc4Bik1可作为香蕉枯萎菌Foc4内源报告基因并评估探索新的分子生物学技术在香蕉枯萎菌上应用的可能性。

来源：2022年第3期

《热带作物学报》期刊编辑部

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