热带作物学报

作者：王雨, 裴行杰, 傅钇钧, 霍恺森, 梁重钧, 刘丽岩, 王佳, 钮俊

单位：海南大学林学院热带特色林木及观赏植物遗传与种植创新重点实验室，海南海口 570228

关键词：华石斛,内参基因,转录组,稳定性分析

基金：海南省自然科学基金项目(320RC469),海南大学科研启动项目(KYQD(ZR)-22056)

华石斛是海南岛特有的热带兰科植物，具有很高的观赏和药用价值。然而，未确定的内参基因限制了该物种基因表达分析。本研究利用之前华石斛转录组数据，筛选出164个变异系数低（CV≤0.2）和表达量中等（TPM在10~300之间）的候选内参基因。为了避免共表达现象对内参基因稳定性分析的影响，根据GO功能聚类分析结果，从不同的功能群中共筛选出24个候选基因。为避免模板中可能残留的基因组DNA在RT-qPCR扩增过程中产生假阳性，本研究设计了跨越内含子引物，并通过电泳筛选出符合要求的15个候选内参基因的扩增引物。为了确保RT-qPCR扩增的特异性，使用LightCycler 96进行熔解曲线分析。依据15个候选基因的RT-qPCR数据，同时综合多个算法分析，在干旱胁迫下，不同软件分别确定CLP1 & SEC23、SEC23 & CPY71、CLP1 & SEC23和RNG1L & PECT为最佳内参基因，综合排序后选取SEC23和CLP1为华石斛干旱胁迫下最稳定内参基因。在华石斛不同组织中，不同软件分别确定了ADF11 & IBR5、PRP19 & CLP1、ADF11 & CLP1、ACBP2 & IBR5为最佳内参基因，综合分析后确定ADF11和ACBP2为不同组织中最稳定内参基因。结合上述干旱胁迫和不同组织分析数据，最终确定IBR5和CPY71为综合条件下较稳定的内参基因。内参基因验证表明，与传统的Actin内参相比，本研究筛选出的内参基因可获得更为精确的RT-qPCR校准结果，表明所筛选的内参基因具有极高的稳定性。综上所述，本研究为利用转录组数据鉴定稳定内参基因提供思路，首次在华石斛全基因组范围内鉴定稳定内参基因，为进一步研究基因表达和功能奠定基础。

来源：2023年第7期

《热带作物学报》期刊编辑部

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